Eficacia de la producción de tejido. - Grupo transportador Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13737 (2023) Citar este artículo

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Los sistemas de biorreactor son herramientas muy valiosas para generar injertos óseos vivos in vitro. El objetivo de este estudio fue comparar la eficacia del biorreactor de perfusión y rotación en la producción de una construcción de hueso vivo. Se sembraron células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana (BMDSC) en las superficies de armazones a base de hidroxiapatita y se cultivaron durante 21 días en tres condiciones diferentes: (1) cultivo estático en 3D, (2) cultivo en 3D en un biorreactor de perfusión y ( 3) cultivo dinámico 3D en un biorreactor giratorio. La evaluación cuantitativa del número de células mostró que el cultivo en el biorreactor de perfusión redujo significativamente la proliferación celular en comparación con el biorreactor giratorio y el cultivo estático. La prueba de diferenciación osteogénica demostró que las BMDSC cultivadas en el biorreactor giratorio produjeron una cantidad significativamente mayor de osteopontina en comparación con las células cultivadas en el biorreactor de perfusión. Además, la espectroscopia Raman mostró que el cultivo de BMDSC en el biorreactor giratorio mejoró la mineralización de la matriz extracelular (ECM) que se caracterizaba por la sustitución carbonatada de hidroxiapatita de tipo B (asociada con grupos PO43-) y una mayor relación mineral-matriz en comparación con la ECM. de células cultivadas en el sistema de perfusión. Así, se concluyó que el biorreactor rotatorio fue mucho más efectivo que el de perfusión en la generación de constructo de tejido óseo in vitro.

A lo largo de los años, la ingeniería del tejido óseo (BTE) ha ganado un interés cada vez mayor en aplicaciones clínicas para la restauración de defectos óseos. Se ha observado que la BTE puede superar numerosos inconvenientes de los injertos óseos naturales (autoinjertos, aloinjertos y xenoinjertos), como fuentes restringidas de donantes, morbilidad del sitio donante y transmisión de enfermedades. La aplicación de un injerto óseo mediante ingeniería tisular implica los siguientes pasos: (i) aislamiento y expansión de células, (ii) crecimiento de células en la superficie del armazón, (iii) cultivo in vitro de biomaterial sembrado de células para crear un injerto óseo vivo. y (iiii) implantación del injerto producido en el sitio de la lesión1,2. Para crear con éxito el injerto óseo vivo in vitro, la cuestión crucial es imitar el microambiente in vivo exponiendo las células osteoprogenitoras/células madre mesenquimales a estímulos/factores adecuados. Es bien sabido que el método de cultivo estático convencional de construcciones tridimensionales (3D) no es lo suficientemente bueno para proporcionar condiciones apropiadas (por ejemplo, transporte suficiente de nutrientes a las células) para obtener tejido óseo similar al que ocurre in vivo. Por lo tanto, los sistemas de biorreactores pueden usarse para mejorar la robustez y eficiencia de la creación de injertos óseos al controlar parámetros cruciales durante el cultivo celular y proporcionar una distribución celular homogénea, concentraciones suficientes de gases y nutrientes, eliminación de desechos y fuerzas mecánicas3,4. Existen varios tipos de sistemas de biorreactores, por ejemplo, biorreactores de perfusión, biorreactores giratorios, biorreactores de matraz giratorio, que pueden proporcionar condiciones adecuadas para la creación de injertos óseos in vitro.

Los biorreactores de perfusión utilizan un sistema de bomba que perfunde el medio de cultivo de forma continua, proporcionando un transporte masivo adecuado de nutrientes y gases y estímulos mecánicos controlados5. Los sistemas de perfusión generalmente constan de una bomba, un depósito de medio de cultivo, un circuito de tubos, recipientes que sostienen los soportes y un recipiente de desechos3,4. El parámetro importante en estos sistemas es el caudal del medio que puede inducir tensiones de corte en la pared que afectan el microambiente de las células y, por lo tanto, apoyan el proceso de formación ósea2,4. Varios estudios han demostrado que el cultivo celular en los biorreactores de perfusión mejoró la diferenciación osteogénica de las células osteoprogenitoras/células madre mesenquimales en comparación con el cultivo estático al aumentar la expresión de genes relacionados con la osteogénesis (por ejemplo, osteopontina (OPN), fosfatasa alcalina ósea (bALP), osteocalcina (OC), colágeno tipo I (Col I))6,7,8. A su vez, los biorreactores dinámicos (p. ej., biorreactores giratorios, biorreactores de matraz giratorio) se han desarrollado principalmente para suministrar nutrientes y oxígeno de forma homogénea y crear un entorno de bajo cizallamiento que desempeña un papel importante en la mejora de la osteogénesis mediante la activación de vías de señalización de mecanotransducción6,9. El sistema de cultivo celular rotatorio (RCCS) desarrollado por la Administración Nacional de Aeronáutica y del Espacio (NASA) simula condiciones de microgravedad relativa, proporcionando un entorno de bajo cizallamiento y una transferencia de masa óptima9. El RCCS más común consta de una base giratoria con control de la velocidad de rotación y un recipiente que gira horizontalmente. Los biomateriales sembrados con células pueden mantenerse en caída libre o fijarse en una aguja en el recipiente giratorio. Además, este tipo de biorreactor también se puede utilizar sin biomateriales para generar agregados celulares tridimensionales que se asemejan a tejidos in vivo2. De manera similar a los biorreactores de perfusión, algunos estudios han demostrado que el método de cultivo basado en rotación aumentó la expresión de genes relacionados con la osteogénesis (por ejemplo, bALP, OC, Col I) y la mineralización de la matriz extracelular (ECM) en células madre mesenquimales en comparación con el cultivo estático10. 11,12.

Otro aspecto crucial que se debe tener en cuenta al crear el injerto óseo vivo in vitro es la selección de un material de soporte adecuado que sirva como plataforma para la expansión de las células formadoras de hueso. Es importante destacar que el cultivo celular en 3D en la superficie del andamio proporciona condiciones que imitan parcialmente el microambiente in vivo, ya que permite una interacción adecuada entre células, una red de señalización intercelular y una interacción entre los componentes de la matriz extracelular y las células13. Por lo tanto, es crucial que el biomaterial utilizado para la generación de injertos óseos vivos se caracterice por una alta biocompatibilidad, osteoconductividad e, idealmente, osteoinductividad. El andamio que posee todas las características mencionadas respalda la adhesión, migración, proliferación y diferenciación osteogénica celular. Además, los armazones óseos para aplicaciones BTE deben poseer una microestructura macroporosa con redes de poros interconectados para facilitar el crecimiento celular hacia el interior y proporcionar espacio para la formación de nuevos vasos sanguíneos después de la implantación. La alta macroporosidad del biomaterial también asegura una difusión uniforme de nutrientes, metabolitos y gases dentro del implante. Otra característica importante del armazón óseo es su lenta biodegradabilidad que favorece la formación y remodelación natural del hueso in vivo2,3,14,15. También se recomienda que el método de producción de biomaterial de andamio sea rentable15.

El desarrollo de un método de producción rentable y eficiente de injerto óseo in vitro para aplicaciones clínicas es un gran desafío para BTE. Hay varios aloinjertos óseos fabricados con tejido artificial disponibles comercialmente, por ejemplo, INFUSE® (Medtronic Spinal and Biologics, Memphis, TN, EE. UU.), Osteocel® Plus, Osteocel® PRO (Nuvasive, San Diego, CA, EE. UU.), CeLLogix (Omnia Medical, Morgantown, WV, EE. UU.), Trinity ELITE® (Orthofix Medical Inc., Lewisville, TX, EE. UU.)16. Sin embargo, los costos de producción de la mayoría de ellos son altos, lo que hace que el valor del mercado de injertos óseos y sustitutos (que incluyen aloinjertos, sustitutos de injertos óseos, matrices basadas en células) se estime en $2586,30 millones en 2021, y se proyecta que alcance los $4005.26 millones para 203117. Según la literatura disponible, muchos estudios han informado sobre una evaluación biológica de una construcción de tejido óseo mediante bioingeniería después del cultivo en un tipo de sistema de biorreactor6,7,8,10,11,12. Sin embargo, dado que la eficacia de la formación de una estructura ósea in vitro depende en gran medida de las condiciones de cultivo, está justificado comparar varios sistemas de biorreactores que se utilizan con mayor frecuencia para fines de BTE.

Así, el objetivo de este estudio fue comparar la eficacia de los sistemas de perfusión y biorreactor rotatorio en la creación del injerto óseo vivo in vitro. En la investigación se utilizaron el sistema de microbiorreactor Lazar Arrow-MTM (Lazar Research Laboratories, Inc., Los Ángeles, CA, EE. UU.) y el sistema de cultivo celular rotatorio (RCCS, Synthecon, Houston, TX, EE. UU.) como sistema de perfusión y rotación modelo. , respectivamente. Existe una gran diversidad de biorreactores 3D dinámicos para aplicaciones BTE; sin embargo, varios sistemas de biorreactor difieren en términos de rentabilidad, simplicidad de uso, opciones de monitoreo, productividad, escala de producción y aplicaciones recomendadas. El sistema de microbiorreactor Lazar Arrow-MTM pertenece a biorreactores de perfusión fáciles de usar con flujo de medio continuo en un sistema de circuito abierto y con perfusión indirecta (el medio fluye alrededor del biomaterial sembrado de células). A su vez, el RCCS es una tecnología única de cultivo celular en 3D con la capacidad de estimular condiciones relativas de microgravedad. Se utiliza frecuentemente para la generación de modelos celulares y tisulares 3D para diversas aplicaciones. Los biorreactores seleccionados para los fines de este estudio son dispositivos de fácil operación y bajo costo diseñados para funcionar a escala de laboratorio. Sin embargo, a diferencia de los biorreactores típicos utilizados a escala industrial, el control de parámetros cruciales de cultivo, como el pH, la concentración de gases y nutrientes en el medio, y la tensión de corte es imposible debido a la simplicidad de estos dispositivos. Por otro lado, si bien los biorreactores utilizados en la industria para aplicaciones biofarmacéuticas, alimentarias, agrícolas y biotecnológicas tienen la capacidad de controlar condiciones cruciales para la producción a gran escala, son dispositivos muy especializados y tecnológicamente avanzados, lo que genera altos costos en el proceso de producción. . Sin embargo, en este estudio, se aseguraron condiciones constantes de cultivo celular colocando tanto los biorreactores (de perfusión y giratorios) como el cultivo estático (en una placa multipocillo) en una incubadora a 37 ˚C con una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO2. Por lo tanto, todos los grupos probados se sometieron a las mismas condiciones ambientales (es decir, temperatura, humedad, concentración de CO2 y alteración ambiental debido a la apertura/cierre de la puerta del biorreactor). Comparar la efectividad de sistemas biorreactores giratorios y de perfusión seleccionados en la generación de injertos óseos vivos, células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (BMDSC) y un andamio óseo basado en hidroxiapatita previamente desarrollado con alta biocompatibilidad, osteoconductividad y osteoinductividad comprobadas18,19, Se utilizaron 20. El biomaterial modelo seleccionado para estos estudios comparativos está compuesto por nanopolvo de hidroxiapatita y matriz de quitosano/agarosa. Es importante destacar que el biomaterial se caracteriza por una alta bioactividad (capacidad de formar cristales de apatita en su superficie), biodegradabilidad, microestructura rugosa, alta macroporosidad abierta (70 %) e interconectada, resistencia a la compresión comparable a la del hueso esponjoso y conlleva un bajo riesgo de respuesta inflamatoria18. ,19,20, lo que indica que es una buena plataforma para la expansión de las células formadoras de hueso durante la creación de un injerto óseo vivo in vitro. El uso de la estructura ósea con todas las características mencionadas anteriormente aseguró una buena adhesión y proliferación de BMDSC y fue una garantía del éxito de estos estudios comparativos. Además, en este estudio, se realizó un cultivo 3D de BMDSC en condiciones estáticas y sirvió como control de prueba. Se compararon la proliferación, diferenciación y mineralización celular con condiciones de cultivo 3D seleccionadas que proporcionan el microambiente más favorable para el cultivo celular, apoyando la generación de la construcción ósea de la manera más eficiente.

Se produjeron biomateriales altamente macroporosos que actúan como plataforma para el crecimiento celular de acuerdo con el procedimiento descrito en la patente polaca núm. 235822 y con el método descrito previamente19,21. Brevemente, 2 % (p/v) de quitosano (50–190 kDa MW, Sigma-Aldrich Chemicals, Varsovia, Polonia), 5 % (p/v) de agarosa (punto de gel 36 ± 1,5 °C, Sigma-Aldrich Chemicals, Varsovia , Polonia) y nanopolvo de hidroxiapatita al 40 % (p/v) (tamaño de partícula <200 nm, Sigma-Aldrich Chemicals, Varsovia, Polonia) se suspendieron en una solución de ácido acético (Avantor Performance Materials, Gliwice, Polonia) y se mezclaron. Posteriormente se añadió bicarbonato de sodio (Sigma-Aldrich Chemicals, Varsovia, Polonia). La pasta obtenida se transfirió a formas cilíndricas y se sometió a calentamiento (95 °C), enfriamiento, congelación y luego liofilización. Finalmente, los biomateriales resultantes se sumergieron en una solución de hidróxido de sodio (Avantor Performance Materials, Gliwice, Polonia), se lavaron con agua desionizada y se secaron al aire. La microestructura del andamio fabricado se visualizó mediante un microscopio estereoscópico (Olympus SZ61TR, Olympus Polska Sp. z oo, Varsovia, Polonia (Fig. 1). Antes de los experimentos de cultivo celular, los andamios se esterilizaron con óxido de etileno.

Microestructura del andamio fabricado visualizada por un microscopio estereoscópico.

El estudio se realizó con el uso de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana (BMDSC) adquiridas del American Type Culture Collection Cell Bank (ATCC-LGC Standards, Teddington, Reino Unido). Las BMDSC se cultivaron en un medio basal de células madre mesenquimales (estándares ATCC-LGC, Teddington, Reino Unido) suplementado con los componentes del kit de crecimiento de células madre mesenquimales de médula ósea (estándares ATCC-LGC, Teddington, Reino Unido) y antibióticos (10 U/mL). penicilina y 10 µg/mL). Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 95% de aire y 5% de CO2.

Se sembraron BMDSC (pase 2) directamente sobre la superficie de biomateriales (8 mm de diámetro y 3 mm de espesor) colocados en los pocillos de la placa multipocillo de 48 en 500 µl de medio de cultivo completo a una densidad de 1 × 105 células/ml. . Antes de colocar los biomateriales en biorreactores (24 h después de la siembra), se verificó la viabilidad celular en los soportes utilizando un kit de tinción doble Live/Dead (Sigma-Aldrich Chemicals, Varsovia, Polonia) de acuerdo con el método del fabricante. Las células teñidas se observaron utilizando un microscopio de barrido láser confocal (CLSM, Olympus Fluoview con FV1000, Olympus Polska Sp. z oo, Varsovia, Polonia). A continuación, parte de los biomateriales sembrados con células se dejó en los pocillos de la placa de 48 pocillos múltiples y se trató como un cultivo 3D estático (muestras marcadas como mat_S), mientras que la parte restante de los biomateriales sembrados con células se colocó en el biorreactor de perfusión. (Lazar Arrow-MTM Micro Bioreactor System, Lazar Research Laboratories, Inc., Los Ángeles, CA, EE. UU.) (muestras marcadas como mat_P) y en el biorreactor giratorio (Rotary Cell Culture System (RCCS), Synthecon, Houston, TX, EE. UU. ) (muestras marcadas como mat_R) con una velocidad de rotación continua igual a 1 rpm. La Figura 2 demuestra la configuración representativa de culturas 3D estáticas y dinámicas. Los cultivos de células 3D en condiciones estáticas y en el biorreactor de perfusión se mantuvieron en los pocillos independientes de la placa. En el caso del biorreactor giratorio, los biomateriales sembrados de células se fijaron en las agujas y se cultivaron en el mismo recipiente giratorio. La configuración de cultivos celulares 3D estáticos y dinámicos se llevó a cabo tres veces como tres experimentos independientes.

Configuración de cultivos 3D BMDSC en condiciones estáticas, en el biorreactor de perfusión (Lazar Arrow-MTM Micro Bioreactor System) y en el biorreactor giratorio (Rotary Cell Culture System (RCCS), Synthecon). Las flechas rojas indican la ubicación de biomateriales sembrados con células.

Para inducir la diferenciación osteogénica de BMDSC, las células se cultivaron en el medio osteogénico elaborado con medio de cultivo completo suplementado con β-glicerofosfato 10 mM, ácido ascórbico 50 µg/ml y dexametasona 10-7 M (Sigma-Aldrich Chemicals, Varsovia, Polonia). . El medio osteogénico se añadió a las células después de 24 h de cultivo en la superficie de los biomateriales en un medio de cultivo completo. A continuación, las configuraciones de cultivo celular estático y biorreactor se transfirieron a la incubadora y se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 95 % de aire y 5 % de CO2. En el caso del cultivo celular estático, las células se cultivaron en 500 µL de medio osteogénico y cada cuatro días, la mitad del medio se reemplazó con una porción nueva. A su vez, las BMDSC mantenidas en el biorreactor de perfusión se cultivaron en los soportes colocados en los pocillos de una placa multipocillo de 6 en 5 ml de medio osteogénico con una velocidad de perfusión (caudal medio) de 20 µl/min. En el biorreactor giratorio, los biomateriales con semillas celulares se fijaron en una aguja que está unida a una base del recipiente giratorio que contiene 50 ml del medio osteogénico. Cada cuatro días, se reemplazaron 10 ml del medio con una porción nueva. Después de 21 días de cultivos 3D estáticos y dinámicos, los biomateriales se sometieron a diversos análisis que se describen en las siguientes subsecciones.

La evaluación del crecimiento celular y la morfología en la superficie de los biomateriales 24 h después de la siembra y después del cultivo a largo plazo (21 días) en condiciones estáticas y dinámicas se realizó mediante tinción del citoesqueleto y los núcleos con falotoxina conjugada con AlexaFluor635 y DAPI, respectivamente. Las células se fijaron con paraformaldehído, se permeabilizaron con Triton X-100, se bloquearon con albúmina sérica bovina (todos los reactivos de Sigma-Aldrich Chemicals, Varsovia, Polonia) y se tiñeron con falotoxina conjugada con AlexaFluor635 (Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.) y DAPI (Sigma-Aldrich Chemicals, Varsovia, Polonia) de acuerdo con el método descrito anteriormente22. Las células teñidas se observaron utilizando el CLSM y las imágenes obtenidas se analizaron utilizando el software ImageJ versión 1.52a para contar los núcleos celulares. Además, la visualización de biomateriales sembrados de células también se realizó mediante un microscopio electrónico de barrido (SEM, JEOL JCM-6000Plus, Japón). Para la visualización SEM, las muestras se prepararon mediante fijación con paraformaldehído y deshidratación en etanol graduado. A continuación, las muestras deshidratadas se pulverizaron con una fina capa de oro. El protocolo detallado para la preparación de muestras se describió anteriormente23.

La proliferación celular se evaluó mediante la medición del contenido de lactato deshidrogenasa (LDH) citoplasmática total después de la lisis celular utilizando el kit de ensayo de actividad de lactato deshidrogenasa (Sigma-Aldrich Chemicals, Varsovia, Polonia). Para determinar el aumento del número de células con el tiempo, el ensayo se realizó en dos intervalos de tiempo: (1) 24 h después de la siembra celular y (2) después de 21 días de cultivo. El ensayo se llevó a cabo según el procedimiento del fabricante. Según el protocolo, el contenido de LDH total detectado tras la lisis celular es proporcional al número de células de una población. Por lo tanto, cuanto más altos fueron los valores de OD a 490 nm con la longitud de onda de referencia de 690 nm, mayor fue el número de BMDSC presentes en los biomateriales.

Para evaluar el proceso de diferenciación osteogénica de las BMDSC, se determinaron marcadores osteogénicos (colágeno tipo I (Col I), osteopontina (OPN), sialoproteína ósea 2 (BSP2), osteocalcina (OC)) en lisados celulares utilizando ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas apropiados ( ELISA) (kit ELISA EIAab, Wuhan, China). Los lisados celulares se obtuvieron mediante dos ciclos de congelación-descongelación y un proceso de sonicación (procesador ultrasónico UO100H Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Alemania) durante 30 s con una amplitud del 30%. El nivel de marcadores osteogénicos se normalizó con respecto al contenido de proteína celular total, que se estimó para cada muestra utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.). Los resultados de ELISA se expresaron como ng de marcador osteogénico por ml (denominados resultados de ELISA originales) y como ng de marcador osteogénico por mg de proteínas celulares totales (datos de ELISA normalizados). La diferenciación osteogénica también se determinó mediante tinción inmunofluorescente (IF) de marcadores osteogénicos (Col I y osteonectina (ON)). Las muestras para tinción IF se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente22.

La espectroscopia Raman de las muestras se realizó utilizando un microscopio Raman DXR (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). El dispositivo estaba equipado con un láser de onda de excitación de 780 nm y una potencia de salida de 15 mW. Para obtener la mejor intensidad Raman de los espectros registrados, los parámetros de medición se optimizaron en el rango espectral de 900 a 1000 cm −1 con un objetivo de 10 × y una cámara CCD. Se utilizó una apertura de 50 orificios. Para el análisis de espectros, se registraron 30 mediciones con un software dedicado (Omnic ver. 8.2.0.387, Thermo Fisher Scientific, Madison, WI, EE. UU.). El análisis espectral, el análisis de componentes principales (PCA) y el análisis hiperespectral se realizaron con el paquete de procesamiento de datos hiperespectrales Orange, con el software Quasar (ver. 1.5.0). Los pasos de preprocesamiento elegidos fueron la selección del rango espectral para 200–2000 cm-1, el suavizado de Savitzky Golay usando un algoritmo de 2 puntos y la normalización a la banda de 960 cm-1.

Se utilizaron diferentes proporciones de picos Raman para visualizar la maduración ósea espacial. Para cada píxel, el color muestra la proporción de esos dos picos en ese píxel con una escala de mapa de calor con valores fijos de mínimo a máximo entre grupos. Para realizar estos análisis se utilizó el software CytoSpec (versión 2.00.01, Berlín, Alemania).

Los experimentos se realizaron al menos por triplicado (n ≥ 3). Los datos obtenidos se mostraron como valores medios ± DE. Los resultados estadísticamente significativos entre muestras se consideraron a P <0,05 utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey (software GraphPad Prism 8.0.0).

La Figura 3 muestra la evaluación de la viabilidad, adhesión, morfología y número de células antes y después de 21 días de cultivo en condiciones estáticas y dinámicas. Antes de colocar biomateriales sembrados con células en los biorreactores, la viabilidad y la morfología celular se determinaron mediante tinción con filamentos vivos/muertos y de actina F, respectivamente (Fig. 3a). Las imágenes del microscopio de barrido láser confocal (CLSM) mostraron una gran cantidad de células viables (fluorescencia verde) en las superficies de los armazones óseos 24 h después de la siembra. Además, la tinción de los filamentos de actina F mostró que las BMDSC estaban bien diseminadas y tenían una morfología aplanada, lo que indica su buena adhesión y crecimiento en la superficie de los biomateriales. Después de 21 días de cultivo, las imágenes CLSM mostraron que las células cultivadas en la superficie de los biomateriales en el biorreactor giratorio (mat_R) alcanzaron una confluencia completa, mientras que las células mantenidas en el biorreactor de perfusión (mat_P) alcanzaron aprox. 70% de confluencia. A su vez, las BMDSC después del cultivo en condición estática (mat_S) mostraron aprox. 90% de confluencia (Fig. 3b). Así, los resultados obtenidos demuestran que la superficie de los biomateriales favoreció la proliferación celular independientemente de las condiciones de cultivo aplicadas. Esta observación se confirmó mediante una evaluación cuantitativa del número de células realizada mediante ensayo de LDH total y recuento de núcleos utilizando el software ImageJ. El análisis demostró que el número de BMDSC en la superficie de los biomateriales después del cultivo en el biorreactor de perfusión (mat_P) fue significativamente menor (P <0,0001) en comparación con el cultivo estático (mat_S) y el cultivo en el biorreactor giratorio (mat_R) (Fig. 3b,c).

Evaluación de la viabilidad, morfología y proliferación de BMDSC: (a) Imágenes CLSM de BMDSC en la superficie de armazones óseos antes del cultivo en los biorreactores (tinción viva/muerta: la fluorescencia verde indica células viables, la fluorescencia roja indica células muertas; actina F filamentos y tinción DAPI: la fluorescencia roja indica filamentos del citoesqueleto, la fluorescencia azul indica núcleos; aumento × 100); (b) Imágenes CLSM de BMDSC en la superficie de estructuras óseas después de 21 días de cultivo en condiciones estáticas y dinámicas (la fluorescencia roja indica filamentos del citoesqueleto, la fluorescencia azul indica núcleos; el número de células se evaluó mediante el conteo de núcleos por 1 cm2 de superficie de biomaterial usando Software ImageJ versión 1.52a; aumento × 100); (c) evaluación de la proliferación celular mediante ensayo de LDH total (*resultados estadísticamente significativos en comparación con mat_S, #resultados estadísticamente significativos en comparación con mat_P, P <0,05, ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey).

La tinción del citoesqueleto celular (filamentos de actina F) después de un cultivo de 21 días mostró una distribución celular relativamente uniforme en la superficie de los armazones óseos, incluso después del cultivo en condiciones estáticas (Fig. 3b). Los resultados obtenidos son consistentes con las imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) que demostraron grandes láminas de BMDSC en las superficies de los biomateriales después de 21 días de cultivo, independientemente de las condiciones aplicadas (estáticas o dinámicas) (Fig. 4). Además, se observó infiltración celular en los poros de los biomateriales.

Imágenes SEM que presentan BMDSC en la superficie de estructuras óseas después de cultivos 3D estáticos y dinámicos de 21 días (las flechas rojas indican láminas de células; aumento × 170 y × 340).

El nivel de marcadores osteogénicos se determinó mediante ELISA en BMDSC después de cultivos 3D estáticos y dinámicos de 21 días. La Figura 5a presenta los resultados de ELISA originales (sin procesar) (expresados como ng de marcador por ml), mientras que la Figura 5b muestra datos normalizados por mg de proteínas celulares totales. La normalización se realizó para comprobar si una proliferación mejorada y, por tanto, una mayor biomasa celular en la muestra mantenida en el biorreactor giratorio afectaba directamente los resultados del ensayo de diferenciación osteogénica. Curiosamente, la tendencia de los resultados obtenidos se mantuvo sin cambios después de la normalización, es decir, el nivel de marcadores osteogénicos fue mayor para mat_R en comparación con mat_P independientemente de la presentación de los resultados (con normalización o datos ELISA originales). Confirma que el biorreactor giratorio apoyó el proceso de diferenciación osteogénica en mayor medida que el de perfusión. Sin embargo, después de la normalización se observaron menos diferencias estadísticamente significativas entre las muestras. Generalmente, las BMDSC cultivadas en condiciones estáticas (mat_S) produjeron mayores cantidades de marcadores osteogénicos en comparación con las células cultivadas en ambos biorreactores (mat_P y mat_R) (Fig. 5). Los resultados originales de ELISA mostraron que a pesar de una cantidad similar de células presentes en las superficies de los biomateriales después de 21 días de cultivo en condiciones estáticas y en el biorreactor giratorio, la producción de marcadores osteogénicos (Col I con P <0,05 y OC con P <0,05) fue significativamente mayor en BMDSC cultivadas de forma estacionaria (Fig. 5a). Sin embargo, los datos de ELISA normalizados no revelaron diferencias estadísticamente significativas en el nivel de marcadores osteogénicos entre mat_S y mat_R (Fig. 5b). Considerando los resultados sin normalización por mg de proteínas totales, las BMDSC cultivadas en el biorreactor giratorio (mat_R) produjeron cantidades comparables de Col I, BSP2 y OC a las células mantenidas en el sistema de perfusión (mat_P). Sin embargo, se observó que el cultivo 3D en el biorreactor giratorio dio como resultado cantidades significativamente mayores de OPN (P <0,01) (Fig. 5a). Además, el nivel de OPN para mat_R era comparable al de mat_S. Después de la normalización de los resultados, las células cultivadas en el sistema giratorio aún produjeron una mayor cantidad de OPN que las BMDSC cultivadas en el biorreactor de perfusión; sin embargo, los resultados obtenidos no fueron estadísticamente significativos (Fig. 5b). Sin embargo, la normalización reveló una cantidad significativamente mayor de Col I (P <0,01) para la muestra mat_R en comparación con mat_P.

El nivel de marcadores osteogénicos determinado por ELISA en BMDSC después de cultivos 3D estáticos y dinámicos de 21 días. Los resultados se expresaron como (a) ng de marcador por ml (datos de ELISA originales) y como (b) ng de marcador por mg de proteínas celulares totales (datos de ELISA normalizados); *Resultados estadísticamente significativos en comparación con mat_S, #Resultados estadísticamente significativos en comparación con mat_P, P < 0,05, ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey.

Las imágenes CLSM de marcadores osteogénicos seleccionados teñidos mediante la técnica IF no revelaron diferencias notables en las cantidades de Col I y ON en la ECM de BMDSC cultivadas en los sistemas de biorreactor en comparación con las condiciones estáticas (Fig. 6).

Imágenes CLSM que presentan tinción inmunofluorescente de colágeno tipo I y osteonectina en la matriz extracelular de BMDSC después de cultivos 3D estáticos y dinámicos de 21 días (la fluorescencia roja indica colágeno tipo I; la fluorescencia verde indica osteonectina, la fluorescencia azul indica núcleos; aumento × 200).

Los espectros medios resultantes para las muestras investigadas se presentan en la Fig. 7a. Para una mejor comparación, los espectros se normalizaron a la banda más alta a 960 cm-1, asignada al estiramiento ν1 de las bandas P – O en los grupos PO4 de los cristales de hidroxiapatita24. Los espectros tenían rasgos característicos atribuidos a la hidroxiapatita, con bandas máximas en 430, 590, 960, 1045 y 1074 cm-1 correspondientes a vibraciones del grupo fosfato: ν2, ν4, ν1, ν3 y (CO3)2-, respectivamente25. El biomaterial no tratado (nativo) fue la muestra de referencia para los biomateriales sembrados con células mantenidos en condiciones estáticas (mat_S), en biorreactores (mat_P y mat_R) y para el biomaterial no sembrado incubado en el medio de cultivo (muestra marcada como control). Los espectros completos de nativo, control y mat_S parecían idénticos. La transformación a fosfato de calcio amorfo (ACP) no se observó en los espectros, debido a la falta de cambio de banda de 960 a 950 cm-1 en los espectros promedio24. Sin embargo, la segunda derivada reveló en mat_S (Fig. 7b) un pequeño cambio de 960 a 961 cm-1 que puede asignarse a una forma menos cristalina de hidroxiapatita26. Es de destacar que mat_R tuvo una intensidad más baja en el rango de 1200-1600 cm-1, correspondiente a los componentes orgánicos de la hidroxiapatita biogénica, en comparación con todos los demás grupos27.

Análisis Raman de biomateriales sembrados con células después de cultivos 3D estáticos y dinámicos de 21 días: (a) espectros medios Raman para las muestras investigadas normalizadas a 960 cm-1; (b) segunda derivada de los espectros Raman en el rango 940–980 cm-1; (c) un gráfico de puntuación del análisis de componentes principales (PCA) de las muestras de control y investigadas con 83% de varianza (biomaterial nativo no tratado, control: biomaterial no sembrado incubado en el medio de cultivo).

Para comparar la varianza de los materiales investigados, se realizó un Análisis de Componentes Principales (PCA) en conjuntos de datos de 400 espectros/grupo. El diagrama de dispersión de PC1 frente a PC2 se muestra en la Fig. 7c, calculado para espectros Raman. Se puede observar que hubo una superposición entre las muestras de control y nativas, y se observó una buena separación de espectros en dirección a PC1, que representó el 83% de la varianza. Claramente, mat_P y mat_R estaban ubicados en diferentes regiones del gráfico de puntuación. Los datos de PCA resultantes coincidieron con los espectros promediados, difiriendo en el rango 1012-1096 cm-1 asignado a las vibraciones ν3 de un grupo fosfato.

Según un método validado por Taylor et al. La relación de área máxima de ν1 PO4/δ CH2 se consideró una relación mineral/matriz Raman (MMR)28. Los resultados calculados de MMR y otras proporciones se muestran en la Tabla 1. MMR no difirió entre las muestras nativas (10.52174) y de control (10.07191). Se observó una disminución de la mineralización en mat_S (8.783927) y mat_P (9.79339), pero se observó un aumento en mat_R (14.53026). La disminución en los valores de MMR detectada para mat_S y mat_P en comparación con las muestras nativas (sin tratar) y de control (sin semillas, incubadas en medio de cultivo) fue probablemente el resultado de la presencia de una gran cantidad de células en los andamios que produjeron ECM. proteínas. Mientras que los biomateriales nativos y de control a base de hidroxiapatita no estaban cubiertos por componentes orgánicos en forma de células y proteínas ECM, los valores de MMR para estas muestras fueron más altos debido a la presencia de constituyentes minerales en la superficie. A su vez, se calcula un valor de MMR más alto para mat_R en comparación con las muestras nativa y control a pesar de la presencia de una gran cantidad de células en su superficie (como se demostró en ensayos de crecimiento y proliferación celular, Figs. 3b, cy Fig. 4). ) es una fuerte evidencia de una mayor mineralización del cultivo 3D en el biorreactor giratorio. Se realizó una evaluación espectral adicional de hidroxiapatita mediante relaciones de intensidad de banda en relación con las principales redes de fosfato. Se investigaron 430 y 590 a 960 cm-1, pero los resultados se parecían al control y a los adquiridos en biorreactores. Sin embargo, los resultados adquiridos a partir de la intensidad de la sustitución B de ν3 a ν1 y ν1 CO3 difirieron significativamente entre las muestras. La sustitución de carbonatos (CO32-) es uno de los procesos importantes en el metabolismo mineral y óseo, que depende de la edad de los individuos29. El tipo B está relacionado con los huesos naturales en su fase temprana y el tipo A es más común en los de mayor edad30. Se informó que las bandas típicas para el tipo B fluctúan entre 1065-1075 cm-1 y las del tipo A en el rango31 1095-1103 cm-1. El rendimiento biológico mejorado de la hidroxiapatita sustituida con CO32 puede hacer que los injertos óseos sean más propensos a la remodelación después de la implantación32. Para evaluar las diferencias entre las muestras, se utilizaron proporciones de bandas seleccionadas.

La maduración del mineral en las muestras se comparó con la distribución de proporciones indicada por los cambios de intensidad en las bandas de fosfato (1077 y 960 cm-1) y carbonato (1070 cm-1) y se presenta en la Fig. 8 con rangos fijos para una mejor comparación entre muestras33. La distribución de fosfato a carbonato tipo B (I1077:I1070) se distribuyó uniformemente en todos los grupos investigados. Curiosamente, la hidroxiapatita total a carbonato tipo B (I960:I1070) reveló una mayor sustitución en mat_R y ligeramente en mat_P, revelando una estructura similar a un hueso recién formada31,33.

Imágenes de distribución Raman del pico ν1 PO34− (960 cm−1), relación de HA fosfato/HA carbonatada (960/1070 cm−1) y relación de HA total/HA carbonatada (1077/1070 cm−1) (nativo: sin tratar). biomaterial, control: biomaterial no sembrado incubado en el medio de cultivo).

La función principal del esqueleto es soportar las cargas del cuerpo, por lo que está sometido a una estimulación mecánica constante. La carga ósea dinámica y los estímulos mecánicos emergentes son factores importantes en el proceso de regeneración ósea in vivo34. En BTE, los biorreactores son sistemas dinámicos muy valiosos para imitar el microambiente del hueso natural en condiciones in vitro, ya que pueden controlar y proporcionar parámetros apropiados durante el cultivo celular al garantizar estímulos mecánicos. Además, los sistemas de biorreactores son herramientas cruciales para generar construcciones de tejido óseo ex vivo mediante el cultivo de células autólogas formadoras de hueso en la superficie de biomateriales porosos tridimensionales. En este estudio, se cultivaron BMDSC en la superficie de estructuras basadas en hidroxiapatita previamente desarrolladas con características microestructurales y mecánicas comparables al hueso esponjoso19. Se aplicaron tres condiciones diferentes: (1) cultivo celular 3D estático (mat_S), (2) cultivo 3D en el biorreactor de perfusión con un caudal de 20 μL/min (mat_P) y (3) en el biorreactor giratorio con un caudal de rotación de 1 rpm (mat_R). Este enfoque permitió la selección de las condiciones de cultivo 3D más efectivas para generar el injerto óseo vivo in vitro.

En estos estudios se demostró que el cultivo de células madre mesenquimales en el biorreactor giratorio dio como resultado una proliferación significativamente mayor (P <0,0001) en comparación con el sistema de perfusión (Fig. 3b, c). Es una cuestión importante ya que el número de células adecuado es crucial para garantizar una biomasa celular suficiente para la diferenciación osteogénica y el proceso de formación ósea35. Los resultados obtenidos son consistentes con los estudios de Yamada et al.8, quienes informaron que durante la perfusión directa (caudal de 1,6 ml/min), la proliferación de BMDSC de rata en andamios a base de poliéster se inhibió significativamente. De manera similar, Salifu et al.6 demostraron que los osteoblastos fetales humanos (línea celular hFOB 1.19) cultivados en la superficie del armazón de policaprolactona/hidroxiapatita en el sistema de perfusión (perfusión directa con un caudal de 1,6 ml/min) mostraban una proliferación reducida. Curiosamente, Mitra et al.36 revelaron que el cultivo de perfusión indirecta (el volumen del medio en el biorreactor era de 12 ml; caudal de 3 ml/min) de BMDSC sembradas en un andamio de hidroxiapatita/poli(lactida-co-glicolida) aumentaba el número de células. Cabe señalar que las divergencias observadas en los informes en la literatura disponible sobre el efecto del cultivo en biorreactores de perfusión sobre la proliferación celular pueden deberse a los distintos caudales, cámaras de cultivo, tipo de perfusión (directa o indirecta), origen de las células madre, Volumen y tipo de medio de cultivo y soportes utilizados. En este estudio, el caudal aplicado en el biorreactor de perfusión fue muy bajo (20 μL/min) en comparación con los sistemas descritos en la literatura (desde 0,1 ml/min hasta incluso 10 ml/min)7,8,37,38. Además, las células se cultivaron en un pequeño volumen de medio (5 ml) en un sistema de circuito abierto, mientras que otros autores utilizaron perfusión directa o un mayor volumen de medio de cultivo o un sistema de circuito cerrado. El medio de cultivo y el caudal aplicados en este volumen de investigación se seleccionaron experimentalmente durante estudios piloto para proporcionar la mayor viabilidad y tasa de crecimiento celular. El tipo de soporte utilizado para el cultivo celular también tiene un gran impacto en los resultados finales. Por ejemplo, Yamada et al. utilizaron un andamio microporoso8, mientras que en este estudio se utilizó un andamio caracterizado por una alta macroporosidad. En particular, se observó que las BMDSC tenían la capacidad de crecer en la red de poros interconectados de los andamios, lo cual es un fenómeno importante para la generación de tejido óseo in vitro ya que facilita la formación natural de hueso3. Todas las diferencias mencionadas en la configuración experimental dificultan la comparación de los resultados obtenidos con los informes de otros autores.

Las BMDSC han sido consideradas como una de las fuentes celulares más adecuadas para BTE debido a su buena capacidad de diferenciación osteogénica39. El procedimiento estándar para la inducción de la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales in vitro es el cultivo celular en presencia de dexametasona (un glucocorticoide sintético), ácido ascórbico y β-glicerofosfato40. La diferenciación osteogénica es un proceso complejo y de múltiples etapas en el que cada paso se caracteriza por marcadores típicos: (1) fase proliferativa, (2) síntesis y maduración de la ECM y (3) mineralización de la ECM. En el primer paso de la diferenciación osteogénica, las células proliferan activamente para asegurar suficiente biomasa celular para la diferenciación osteogénica y el proceso de formación ósea y producen principalmente Col I y fibronectina. En la primera etapa, las células también exhiben una baja actividad de bALP, una producción de OPN de baja a moderada y expresan el factor de transcripción 2 relacionado con Runt (RUNX2). Luego, hay una disminución de la tasa de proliferación y las células comienzan a expresar actividad bALP en un nivel alto, lo que proporciona fosfatos durante el proceso de mineralización de la ECM. En la última etapa, se observa una alta expresión de OC, OPN, ON y BSP, seguida de la deposición de calcio y fosfato (fase de mineralización de la ECM)41,42,43.

En este estudio, se evaluó el nivel de marcadores osteogénicos típicos (Col I, OPN, BSP2 y OC) producidos por BMDSC cultivadas en la superficie de los biomateriales en condiciones estáticas y dinámicas después de un cultivo de 21 días mediante ELISA (Fig. 5). . Se observó que las células cultivadas en condiciones estáticas (mat_S) produjeron mayores cantidades de marcadores osteogénicos en comparación con las células cultivadas en biorreactores (mat_P y mat_R). Curiosamente, los resultados obtenidos en este estudio no concuerdan con los informes de la literatura disponible sobre el aumento en la producción de marcadores osteogénicos por células madre mesenquimales después del cultivo en biorreactores6,7,8,10,11. Se asumió que una mayor producción de marcadores osteogénicos en cultivos 3D mantenidos en condiciones estáticas era el resultado de un pequeño volumen (500 µL) del medio de cultivo que contenía factores de crecimiento más concentrados y citoquinas (señales autocrinas y paracrinas) responsables de la promoción de la diferenciación osteogénica. . Por el contrario, mat_P se cultivó en 5 ml de medio osteogénico con un caudal medio de 20 µl/min, mientras que mat_R se cultivó en 50 ml de medio osteogénico. La frecuencia de la renovación del medio también podría haber afectado la diferenciación osteogénica. En el caso de mat_S y mat_R, la renovación del medio se produjo cada cuatro días, lo que fue suficiente para mantener una alta viabilidad de las BMDSC gracias a su cultivo en muestras 3D y altamente porosas (la fase de retraso, conocida como fase de adaptación, es más larga y la tasa de proliferación es más alta). más lento en andamios 3D en comparación con el cultivo 2D). Era media porción (250 µL) para mat_S y 10 ml (de 50 ml) para mat_R. Mientras que el flujo continuo del medio en el sistema de perfusión dio como resultado la renovación de 28,8 ml del medio cada día, la frecuencia llegó a 5,76 veces al día. Es bien sabido que el grado de diferenciación osteogénica de las células madre mesenquimales depende en gran medida de un nivel de factores intrínsecos y extrínsecos, incluidas las células circundantes (regulación paracrina) y las señales secretadas por las propias células (regulación autocrina)44. Así, el mantenimiento del cultivo 3D en una pequeña cantidad de medio de cultivo aumentó la concentración de moléculas cruciales responsables de la promoción de la diferenciación osteogénica en el microambiente circundante. Sin embargo, el objetivo principal de este estudio fue comparar la efectividad de dos sistemas de biorreactor comúnmente utilizados (biorreactor de perfusión—Lazar Arrow-MTM Micro Bioreactor System y biorreactor giratorio—RCCS, Synthecon) en la formación del injerto óseo in vitro, mientras que el 3D El cultivo en condiciones estáticas sirvió sólo como control de prueba. La evaluación comparativa de estos dos sistemas de biorreactor indicó que el sistema giratorio apoyaba más la diferenciación osteogénica que el de perfusión, ya que condujo a una producción de OPN (datos ELISA originales) y a una síntesis de Col I (P < 0,05) significativamente mayores (P < 0,01). datos ELISA normalizados). Curiosamente, Gandhi et al.7 informaron que las BMDSC de rata encapsuladas dentro de perlas de fibrina y cultivadas en el biorreactor de perfusión con un caudal de 10 ml/min exhibieron una mayor expresión de OPN. La OPN es una proteína no colagenosa y es responsable de la unión del calcio y del proceso adecuado de mineralización de la MEC41. Por lo tanto, es un marcador osteogénico importante en la formación de nuevo tejido óseo mineralizado in vivo y un predictor prometedor durante la producción de injerto óseo in vitro. La diferenciación osteogénica de BMDSC cultivadas en condiciones estáticas y dinámicas también se determinó mediante tinción con Col I y ON utilizando la técnica IF (Fig. 6). Col I es la proteína colágena más abundante en la ECM de los huesos y desempeña un papel fundamental en la determinación de la resistencia ósea. Mientras que ON (también conocido como SPARC) es un marcador tardío de diferenciación osteogénica (la fase de mineralización) y pertenece a las proteínas no colágenas que regulan la liberación de calcio al unir cristales de colágeno e hidroxiapatita, afectando así la mineralización del colágeno durante la formación ósea45. Es importante destacar que la tinción IF realizada de proteínas de la ECM mostró que las BMDSC cultivadas en la superficie de andamios a base de hidroxiapatita, tanto en condiciones estáticas como dinámicas, formaron una red 3D expandida de ECM, que desempeña un papel fundamental en la regulación de la adhesión, proliferación y diferenciación celular. en vivo45. Por lo tanto, un injerto óseo vivo con una microestructura ECM evolucionada, que se creó en condiciones in vitro en este estudio, puede mejorar la formación de hueso nuevo en el sitio de la fractura, apoyando la reparación y regeneración del hueso dañado.

La espectroscopia Raman se utiliza ampliamente en la investigación sobre biominerales y biomedicina y proporciona información estructural a nivel microscópico. En particular, su capacidad para evaluar simultáneamente materia mineral y orgánica se considera beneficiosa en la investigación relacionada con los huesos46,47,48. La transformación de fase de hidroxiapatita y la sustitución de carbonato son posibles de investigar a micro y nanoescala con dispositivos Raman modernos en diversos aspectos, debido a la preparación mínima necesaria49,50. La hidroxiapatita natural es una estructura no estequiométrica que contiene grupos carbonato integrados en la estructura. Los iones carbonato disminuyen la cristalinidad y el crecimiento de los cristales y aumentan la solubilidad de la hidroxiapatita en un ambiente ácido que es creado naturalmente por los osteoclastos activos, mejorando así la biodegradación de la hidroxiapatita46,51. Según la posición del cristal del carbonato, la apatita se divide en tipo A y tipo B (asociados con grupos OH- y PO43-, respectivamente)31. En general, las mediciones Raman de la matriz mineral y orgánica permitieron la comparación de la mineralización de la ECM en biomateriales sembrados de células mantenidos en condiciones estáticas y dinámicas. No se observó la transformación directa a fosfato de calcio amorfo, pero la sustitución carbonatada de hidroxiapatita de tipo B y una mayor relación mineral-matriz en el mat_R indicaron claramente que el biorreactor giratorio proporcionó condiciones más eficientes para la fabricación de la construcción ósea in vitro.

Las herramientas BTE pueden superar muchas de las limitaciones y complicaciones asociadas con la aplicación clínica de injertos óseos naturales. Sin embargo, la formación eficaz de injertos óseos vivos in vitro sigue siendo un gran desafío para la BTE. En este estudio, se presentó un análisis comparativo de diferentes condiciones de cultivo 3D utilizando perfusión y biorreactores giratorios para seleccionar el sistema más eficaz que proporcione un microambiente favorable para el cultivo celular y respalde la generación de la construcción ósea in vitro. La evaluación biológica y el análisis Raman de biomateriales sembrados con células después de 21 días de cultivo mostraron que el biorreactor giratorio (Rotary Cell Culture System, Synthecon) es una mejor herramienta para producir injertos óseos de ingeniería tisular para aplicaciones de medicina regenerativa que el biorreactor de perfusión (Lazar Arrow). -MTM Micro Bioreactor System) ya que ejerció un efecto superior en la respuesta celular, por ejemplo, apoyando la proliferación de BMDSC, la síntesis de ECM y la mineralización. Es importante destacar que la ECM mineralizada se caracterizó por una sustitución carbonatada de hidroxiapatita de tipo B (asociada con grupos PO43-) y una mayor relación mineral-matriz, lo que revela una estructura similar a un hueso recién formada. Por lo tanto, el sistema giratorio no solo proporcionó una mayor biomasa celular en la estructura ósea, sino que también promovió la formación de estructuras similares a los huesos bien mineralizadas. Curiosamente, según los resultados originales (sin procesar) de ELISA, las células cultivadas en condiciones estáticas (que sirvieron solo como control de prueba) produjeron mayores cantidades de marcadores osteogénicos en comparación con las células cultivadas en ambos biorreactores. Sin embargo, la normalización de los resultados de ELISA para las proteínas celulares totales no reveló diferencias estadísticamente significativas entre los soportes cultivados en condiciones estáticas y en el sistema giratorio. Además, cabe señalar que el cultivo de biomateriales sembrados de células en el biorreactor giratorio permitió que las células crecieran demasiado en toda la superficie del biomaterial, aumentando la capacidad de formación de hueso de las construcciones diseñadas con tejidos. Por el contrario, el cultivo de las células en condiciones estáticas permitió la formación de una estructura similar a un hueso sólo en la superficie superior del biomaterial.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio de datos de Mendeley, https://doi.org/10.17632/xj8mpsdt6k152.

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Esta investigación fue financiada por el Centro Nacional de Ciencias (NCN) de Polonia dentro del marco de la subvención OPUS 22 no. UMO-2021/43/B/NZ7/00447. A los efectos del acceso abierto, los autores han aplicado una licencia pública de derechos de autor CC-BY a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor (AAM) que surja de este envío. La investigación también contó con el apoyo parcial del Ministerio de Educación y Ciencia de Polonia dentro de la actividad estatutaria de la Universidad Médica de Lublin (proyecto PBmb2/2021). Los autores desean agradecer a Michal Wojcik de la Unidad Independiente de Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa de la Universidad Médica de Lublin (Polonia) por su ayuda con el análisis con microscopio confocal.

Unidad Independiente de Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa, Universidad Médica de Lublin, Calle Chodzki 1, 20-093, Lublin, Polonia

Paulina Kazimierczak y Agata Przekora

Unidad Independiente de Espectroscopia e Imágenes Químicas, Universidad Médica de Lublin, Calle Chodzki 4a, 20-093, Lublin, Polonia

Grzegorz Kalisz y Anna Sroka-Bartnicka

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El manuscrito fue escrito gracias a las contribuciones de todos los autores. Todos los autores han dado su aprobación a la versión final del manuscrito. PK: conceptualización, metodología, recursos, investigación, análisis de datos, visualización de datos; escritura—borrador original; GK: investigación, análisis de datos, redacción: borrador original; ASB: metodología, recursos, redacción: revisión y edición; AP: conceptualización, metodología, recursos, administración de proyectos, supervisión, redacción—revisión y edición.

Correspondencia a Paulina Kazimierczak.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kazimierczak, P., Kalisz, G., Sroka-Bartnicka, A. et al. Efectividad de la producción de injerto óseo vivo mediante ingeniería tisular: un estudio comparativo utilizando sistemas de perfusión y biorreactores rotativos. Informe científico 13, 13737 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41003-w

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Recibido: 24 de mayo de 2023

Aceptado: 20 de agosto de 2023

Publicado: 23 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41003-w

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