Electroforesis en gel de agarosa, cómo funciona y sus usos

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Leyes simples de la física dictan que cuando se aplica corriente a un medio que contiene especies cargadas, esas especies migrarán hacia la carga opuesta. Dependiendo del medio por el que se mueven, otras características (como el tamaño de las especies presentes) pueden afectar su movimiento y provocar la separación. Esta es la base sobre la que se construyen las técnicas de electroforesis, como la electroforesis en gel de agarosa, técnicas que se utilizan ampliamente en las ciencias de la vida.

En este artículo consideraremos cómo funciona la electroforesis en gel de agarosa, cómo se puede interpretar y algunos de sus propósitos.

La electroforesis es una técnica que utiliza corriente eléctrica para separar ADN, ARN o proteínas en función de sus propiedades físicas como el tamaño y la carga.

La electroforesis en gel de agarosa es una forma de electroforesis que se utiliza para la separación de fragmentos de ácido nucleico (ADN o ARN) en función de su tamaño. El ADN/ARN cargado negativamente migra a través de los poros de un gel de agarosa hacia el extremo cargado positivamente del gel cuando se aplica una corriente eléctrica, y los fragmentos más pequeños migran más rápido. Luego, las bandas resultantes se pueden visualizar usando luz ultravioleta (UV).

Sin embargo, el ARN1 tiende a formar estructuras secundarias (a veces múltiples especies diferentes para el mismo fragmento) que afectan la forma en que migra. En consecuencia, las bandas observadas no siempre representan sus tamaños reales y las imágenes son borrosas. Por lo tanto, los geles de agarosa nativos (donde las condiciones no alteran las estructuras naturales de los analitos) tienden a no usarse para el análisis de tamaños de ARN, aunque pueden dar una estimación de la cantidad y la integridad. Las alternativas incluyen la transferencia Northern y la electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante2 que utilizan condiciones capaces de alterar las estructuras secundarias.

Los geles de agarosa también se pueden utilizar para separar proteínas3 según su tamaño y carga (a diferencia del ADN/ARN, las proteínas varían en carga según los aminoácidos incorporados). Sin embargo, debido al gran tamaño de los poros en los geles de agarosa, las proteínas a menudo se separan en geles de poliacrilamida que tienen poros más pequeños, lo que ofrece una mayor resolución para las moléculas de proteínas pequeñas.

Por lo tanto, nos centraremos en la electroforesis de ADN en gel de agarosa durante el resto de este artículo.

La agarosa es un componente del agar. Forma una matriz de gel tridimensional de moléculas de agarosa helicoidales en haces superenrollados sostenidos por enlaces de hidrógeno, con canales y poros a través de los cuales las moléculas pueden pasar. Cuando se calientan, estos enlaces de hidrógeno se rompen, convirtiendo la agarosa en líquida y permitiendo que se vierta en un molde antes de que se reinicie (Figura 1).

El porcentaje de agarosa incluido en un gel afecta el tamaño de los poros y, por lo tanto, el tamaño de las moléculas que pueden pasar y la velocidad a la que lo hacen. Cuanto mayor sea el porcentaje de agarosa, menor será el tamaño de los poros, por lo que más pequeñas serán las moléculas capaces de pasar y más lenta será la migración. En el laboratorio de biología molecular, normalmente se utiliza gel de agarosa al 0,7-1 % para las separaciones diarias de ADN, lo que ofrece una diferenciación buena y clara de fragmentos en el rango de 0,2 a 10 kb. Los fragmentos más grandes se pueden resolver usando geles con un porcentaje más bajo, pero se vuelven muy frágiles y difíciles de manejar, mientras que los geles con un porcentaje más alto darán una mejor resolución de los fragmentos pequeños, pero son quebradizos y pueden fraguar de manera desigual.

La electroforesis en gel se utiliza para separar mezclas de biomacromoléculas, como ADN, ARN y proteínas. Esta técnica separa por tamaño molecular y/o carga. Esto se logra dibujando moléculas a través de un gel que contiene poros diminutos mediante un campo eléctrico.

Como el ADN no es visible a simple vista, se incorpora al gel un tinte intercalado como el bromuro de etidio (EtBr) durante el fraguado. Esto une el ADN y emite fluorescencia bajo luz ultravioleta, lo que permite visualizar los fragmentos de ADN. Cuanto más ADN esté presente, más brillante será la banda.

Las muestras mezcladas con un tinte de carga se colocan en un extremo del gel que se sumerge en un tampón de proceso. Luego se hace pasar una corriente eléctrica a través del gel mediante electrodos en cada extremo del tanque de gel (Figura 2).

Cuando las muestras han corrido lo suficiente como para obtener una separación suficiente, se retira el gel del tanque y se coloca en una caja de luz ultravioleta. Luego, el tinte intercalante permite visualizar las bandas de muestra y determinar su tamaño en comparación con una escalera de ADN con tamaños de banda conocidos. La relación entre la distancia de migración y el tamaño del fragmento no es lineal, lo que aumenta la importancia de incluir marcadores de tamaño como guía (Figura 3).

Hay una serie de pasos clave4 involucrados en la elección, configuración, ejecución y análisis de geles de agarosa que ahora consideraremos.

1. Determine el porcentaje de gel requerido: el gel de agarosa entre 0,7 y 1 % suele ser adecuado para la mayoría de las aplicaciones, pero es importante elegir un porcentaje apropiado para sus muestras y los tamaños de fragmentos esperados. Combine el polvo de agarosa con el mismo tipo de tampón que se utilizará para hacer funcionar el gel y caliente para derretir la mezcla, evitando que hierva. El ácido tris-acetato-etilendiaminotetraacético (EDTA) (TAE) o tris-borato-EDTA (TBE)5 son a menudo los tampones elegidos, ya que las soluciones de tris-ácido son tampones eficaces para condiciones ligeramente básicas, manteniendo el ADN desprotonado y soluble en agua. El EDTA, un agente quelante, inactiva las nucleasas que pueden dañar el ADN que se analiza.

2. Vierta un gel: elija un molde para colar gel y un peine del tamaño deseado, proporcionando una cantidad suficiente de pocillos para todas las muestras y escaleras y capacidad para contener la cantidad de cada muestra que se va a cargar. Asegure los extremos abiertos del molde con un marco de fundición o cinta para contener el gel mientras fragua. Agregue colorante intercalante de ADN en el fondo del molde; para EtBr, normalmente se usa 0,2-0,5 µg/ml. Actualmente todavía se debate la evidencia de que EtBr es un mutágeno, pero en consecuencia, muchos laboratorios han optado por alternativas6 como GelRed. Agregue el gel, con cuidado de no llenar demasiado el molde, y asegúrese de que el tinte intercalado esté mezclado uniformemente. No viertas el gel cuando esté demasiado caliente o el molde podría deformarse o romperse.

3. Mezcle muestras/escaleras con tinte de carga: los tintes de carga realizan múltiples funciones. Permiten al usuario ver dónde está su muestra que de otro modo sería incolora, lo que facilita pipetear la muestra en el pocillo con precisión y, por lo tanto, reduce la probabilidad de contaminación cruzada de muestras entre los pocillos. Cuando el gel está funcionando, el tinte migra con la muestra, lo que permite al usuario saber a qué parte del gel ha llegado la muestra y evitar que se extienda demasiado y se pierda en el tampón. Las muestras de ADN sin tinte cargado también tenderán a dispersarse en el tampón en ejecución cuando se carguen, ya que son menos densas. Por lo tanto, la mayoría de los tintes de carga contienen glicerol o Ficoll, lo que hace que la mezcla de muestra y tinte sea más densa, por lo que se deposita en el fondo de los pocillos. El azul de bromofenol es una opción colorante popular, pero algunos también contienen colorantes adicionales como el xileno cianol. Si bien se pueden comprar tintes de carga, muchos laboratorios optan por fabricar los suyos propios.7

Si está procesando volúmenes de muestra muy pequeños (p. ej., menos de 5 µl), puede resultar ventajoso agregar un poco de agua en esta etapa para que sea más fácil cargar los pocillos de gel de manera efectiva y uniforme. Del mismo modo, si espera que la concentración de ADN en algunas muestras sea mucho mayor que en otras, también puede ser necesario agregar agua a la mezcla de muestra y tinte de estas muestras concentradas en esta etapa. Si no lo hace, la fuerte señal proporcionada por estas bandas durante la visualización puede enmascarar las bandas más débiles o requerir que las bandas fuertes estén sobreexpuestas para ver las más débiles, creando áreas brillantes y distorsionadas en la imagen del gel.

4. Cargue el gel: retire el marco/cinta de fundición del gel configurado y colóquelo en el tanque de gel, asegurándose de que los pocillos estén en el extremo negativo (electrodos negros). Llene el tanque con tampón (TAE o TBE) para que el gel quede sumergido. Retire con cuidado el peine y pipetee suavemente la mezcla de muestra y tinte (y agua si se usa) en los pocillos. Trate de evitar tocar los bordes de los pocillos con la punta de la pipeta, ya que podrían romperse y permitir que una muestra pase a la siguiente. La sobrecarga de pozos puede tener el mismo resultado. Grandes cantidades de ADN también pueden ralentizar la migración del ADN durante la carrera. Cargue escaleras de marcadores, preferiblemente una en cada extremo de la fila de muestra. Es posible que los geles no siempre se extiendan en una línea perfectamente recta, por lo que tener una escalera en cada extremo facilita determinar los tamaños de los fragmentos presentes. Hay una variedad de escaleras disponibles con distintos tamaños indicados; Elija uno que sea más apropiado para los tamaños de fragmentos que espera ver.

5. Ejecute el gel: coloque la tapa en el tanque con los electrodos de negro a negro y de rojo a rojo y conecte los electrodos a una fuente de alimentación, también de negro a negro y de rojo a rojo. Esto, junto con el tanque de gel, conforma la máquina de electroforesis en gel. Asegúrese de que los electrodos y la tapa estén en la posición correcta, de lo contrario, las muestras saldrán de los pocillos hacia atrás y entrarán en el tampón de ejecución. Establezca la hora y el voltaje al que se ejecutará su gel; 120 V durante 35 minutos es una buena aproximación; sin embargo, esto debe adaptarse al porcentaje de gel utilizado y a los tamaños de fragmentos esperados que se separan para proporcionar una buena separación eléctrica. Aplicar corriente a un gel de agarosa hará que se caliente; cuanto mayor sea el voltaje, más se calentará, por lo que cuando se ejecutan geles de bajo porcentaje, es recomendable utilizar voltajes más bajos para evitar que se derrita. Puede resultar tentador aumentar el voltaje para que el gel funcione más rápido. Sin embargo, esto puede dar lugar a "geles sonrientes", donde las bandas están curvadas hacia arriba en cada extremo, lo que dificulta determinar el tamaño correcto de la banda. Aquí es donde el gel ha comenzado a derretirse ligeramente, lo que hace que las bandas corran de manera desigual. Esto también puede hacer que las bandas luzcan borrosas y mal definidas.

6. Visualización: una vez que las muestras hayan recorrido la mayor parte del gel (el frente del tinte lo hará visible), apague la fuente de alimentación. Con guantes, retire suavemente el gel en el molde del tanque, drene el exceso de tampón y transfiéralo a una caja UV en un recipiente apropiado para su visualización. Cambie los guantes para evitar la contaminación de las superficies circundantes, manijas de puertas, etc. con tinte intercalado del gel o tampón. Si se requieren fragmentos de ADN para aplicaciones posteriores, las bandas correspondientes se pueden extirpar cuidadosamente del gel con una hoja de bisturí mientras se colocan en una caja de luz ultravioleta en una habitación oscura. Asegúrese de usar una protección facial contra rayos UV y de mantener la piel cubierta mientras la caja de luz esté encendida para evitar daños a la piel o a los ojos por la luz ultravioleta.

Los geles de agarosa se pueden visualizar en una caja de luz ultravioleta en una habitación oscura o usando una caja de luz autónoma conectada a una cámara. Cualquiera que sea el sistema utilizado, la luz ultravioleta atraviesa el gel desde abajo y las bandas de ADN emiten fluorescencia gracias al tinte intercalado que se les une. Esto se puede capturar usando una cámara con un filtro UV especializado para sus registros. Las escaleras marcadoras vienen con una guía para indicar el tamaño de cada banda que incluyen. Por lo tanto, comparando esto con las bandas en los carriles de muestra, se pueden determinar los tamaños de las bandas. También se puede comparar la cantidad relativa de ADN entre muestras, ya que concentraciones más altas de ADN producirán bandas más brillantes. Un ejemplo se muestra en la Figura 4.

Hay varias razones por las que la separación de fragmentos de ADN puede ser deseable, muchas de las cuales son ampliamente aplicables en las disciplinas de las ciencias biológicas. Consideremos algunos propósitos comunes.

Término

Definición

Electroforesis en gel de agarosa

Forma de electroforesis utilizada para la separación de macromoléculas, como fragmentos de ADN, en una matriz de agarosa.

Agente quelante

Un compuesto químico que reacciona con iones metálicos para formar complejos metálicos estables y solubles en agua.

Geles de agarosa desnaturalizantes

Los geles de agarosa funcionan en condiciones que alteran la estructura natural del ADN, el ARN o las proteínas, provocando que se desplieguen.

Desprotonación

Eliminación de un protón (H+).

Escalera de ADN/escalera de marcadores

Una solución de fragmentos de ADN de tamaños conocidos que se puede utilizar para extrapolar los tamaños de fragmentos en muestras desconocidas.

Separación eléctrica

La separación de biomoléculas, como ADN, ARN o proteínas, según su tamaño y/o carga mediante corriente eléctrica.

Electroforesis

Técnica que utiliza corriente eléctrica para separar ADN, ARN o proteínas en función de sus propiedades físicas, como el tamaño y la carga.

Ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA)

También llamados ensayos de cambio de gel, los EMSA son una técnica basada en electroforesis que se utiliza para detectar interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Máquina de electroforesis en gel

Equipo utilizado para realizar electroforesis en gel que normalmente consta de un tanque de gel y una fuente de alimentación con electrodos de conexión.

tinte intercalante

Tintes que se unen al ADN de doble cadena, lo que permite visualizarlos bajo luz ultravioleta.

cargando tinte

Tinte utilizado para preparar escaleras de ADN y muestras para electroforesis que permite verlos a simple vista y aumenta su densidad para evitar la dispersión.

Mutageno

Fenómeno químico o físico que promueve errores en la replicación del ADN.

Geles de agarosa nativos

Los geles de agarosa funcionan en condiciones que permiten la preservación de la estructura natural de biomoléculas como el ADN, el ARN o las proteínas.

mancha norte

Técnica utilizada para detectar secuencias de ARN específicas en una muestra que emplea electroforesis para la separación de muestras.

Nucleasas

Enzimas que escinden ácidos nucleicos como el ADN o el ARN.

Electroforesis en gel de poliacrilamida.

Forma de electroforesis utilizada para la separación de macromoléculas, como ácidos nucleicos y proteínas, en una matriz de acrilamida polimerizada.

digestión de restricción

Un proceso que utiliza enzimas para cortar el ADN en sitios específicos según la secuencia de ADN circundante.

Búfer en ejecución

El tampón se utiliza para llenar el tanque en el que se sumerge el gel y se ejecutará. Ayuda a mantener condiciones estables.

Estructura secundaria

La estructura tridimensional adoptada por un polipéptido o polinucleótido resultante de atracciones electrostáticas entre residuos vecinos.

mancha del sur

Técnica utilizada para detectar secuencias de ADN específicas en una muestra que emplea electroforesis para la separación de muestras.

Factores de transcripción

Proteínas involucradas en el proceso de conversión o transcripción de ADN en ARN.

1. Rio DC, Ares M, Hannon GJ, Nilsen TW. Electroforesis de ARN en gel de agarosa no desnaturalizante. Protocolo Cold Spring Harb. 2010;2010(6):pdb.prot5445. doi:10.1101/pdb.prot5445

2. Masek T, Vopalensky V, Suchomelova P, Pospisek M. Electroforesis de ARN desnaturalizante en geles de agarosa TAE. Bioquímica anal. 2005;336(1):46-50. doi:10.1016/j.ab.2004.09.010

3. Krizek DM, Rick ME. Electroforesis de proteínas en gel de agarosa. Curr Protoc Cell Biol. 2002;15(1):6.7.1-6.7.13. doi:10.1002/0471143030.cb0607s15

4. Lee PY, Costumbrado J, Hsu CY, Kim YH. Electroforesis en gel de agarosa para la separación de fragmentos de ADN. J Vis Exp. 2012;(62):3923. doi:10.3791/3923

5. Sanderson BA, Araki N, Lilley JL, Guerrero G, Lewis LK. Modificación de la arquitectura del gel y la composición del tampón TBE/TAE para minimizar el calentamiento durante la electroforesis en gel de agarosa. Bioquímica anal. 2014;454:44-52. doi:10.1016/j.ab.2014.03.003

6. Salón AC. Una comparación de tinciones de ADN y métodos de tinción para electroforesis en gel de agarosa. bioRxiv. 2019.doi:10.1101/568253

7. Colorante de carga de gel de ADN (10X). Protocolo Cold Spring Harb. 2008;2008(8):pdb.rec11373. doi:10.1101/pdb.rec11373

8. Schwarz MJ. Diagnóstico por ADN de la fibrosis quística. Ann Clin Bioquímica. 1998;35(5):584-610. doi:10.1177/000456329803500502

9. Marwal A, Sahu AK, Gaur RK. Capítulo 16 - Marcadores Moleculares: Herramienta para el Análisis Genético. En: Verma AS, Singh A, eds. Biotecnología animal. Prensa académica; 2014:289-305. doi:10.1016/B978-0-12-416002-6.00016-X

10. Tweedie JW, Stowell KM. Cuantificación del ADN mediante electroforesis en gel de agarosa y análisis de los topoisómeros del plásmido y del ADN M13 tras el tratamiento con una endonucleasa de restricción o ADN topoisomerasa I. Biochem Mol Biol Educ. 2005;33(1):28-33. doi:10.1002/bmb.2005.494033010410

11. Molnar C, Gair J. Capítulo 10.1 Clonación e ingeniería genética. En: Conceptos de biología. Publicado en línea el 14 de mayo de 2015. Consultado el 2 de febrero de 2022. https://opentextbc.ca/biology/chapter/10-1-cloning-and-genetic-engineering/

12. Balletbó A. Purificación de ADN a partir de un gel de agarosa (protocolo para el kit de extracción de gel de limpieza NucleoSpin® pCR). protocolos.io. Publicado el 22 de septiembre de 2019. Consultado el 2 de febrero de 2022. doi:10.17504/protocols.io.7hrhj56

13. Downey N. Extracción de ADN de geles de agarosa. En: Casali N, Preston A, eds. Vectores de plásmidos de E. coli: métodos y aplicaciones. Métodos en Biología MolecularTM. Prensa Humana; 2003:137-139. doi:10.1385/1-59259-409-3:137

14. Hellman LM, Fried MG. Ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) para detectar interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos. Protocolo Nacional. 2007;2(8):1849-1861. doi:10.1038/nprot.2007.249

15. Yousaf N, Gould D. Demostración de las interacciones de los factores de transcripción con el ADN mediante el ensayo de cambio de movilidad electroforética. En: Gould D, ed. Promotores sintéticos de mamíferos. Métodos en biología molecular. Saltador; 2017:11-21. doi:10.1007/978-1-4939-7223-4_2

CorrecciónEl artículo decía erróneamente que el electrodo positivo era el cátodo, esto se actualizó el 13 de febrero de 2023 para identificar correctamente el ánodo como el electrodo positivo.